Zell- und Gewebekultur: Allgemeine Grundlagen und spezielle Anwendungen

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Vorwort zur 8. Auflage Über die Autoren Inhaltsverzeichnis Einleitung I Allgemeine Grundlagen der Zell- und Gewebekultur Inhaltsverzeichnis 1 Das Zellkulturlabor: Räumliche und apparative Voraussetzungen 1.1  Der Reinigungsbereich 1.2  Der Vorbereitungs- und Verarbeitungsbereich 1.3  Der Sterilbereich 1.3.1  Die sterile Werkbank 1.3.2  Der Brutschrank 1.3.2.1  Weitere Geräte im Sterilbereich Wartung des Hochleistungsschwebstofffilters Probleme bei Brutschränken und Lösungen Weiterführende Literatur 2 Steriltechnik – Kontaminationen 2.1  Der Sterilbereich 2.2  Laborreinigung 2.3  Hygiene 2.4  „Aseptische“ Arbeitstechnik 2.4.1  Arbeitsfläche 2.4.2  Desinfektion 2.4.3  Pipettieren 2.4.4  Abflammen (Flambieren) 2.4.5  Ultraviolettes Licht (UV) 2.5  Sterilisationsverfahren 2.5.1  Autoklavieren 2.5.1.1  Überwachung der Sterilisation 2.5.1.2  Die Verpackung im Autoklaven 2.5.2  Heißluftsterilisation 2.5.3  Sterilfiltration (Keimfiltration) 2.5.4  Sterilitätstest Autoklavieren Sterilisation von Flaschen Sterilisation von Pipetten Sterilisation eines Membranfilters Sterilfiltration von Medien 2.6  Antibiotika (Verwendung von Antibiotika in der Zellkultur) 2.6.1  Anwendung 2.6.2  Antibiotikafreie Kultur 2.7  Mycoplasmen 2.7.1  Vermeidung von Mycoplasmenkontaminationen 2.7.2  Nachweismethoden von Mycoplasmenkontaminationen 2.7.2.1  Darstellung der Mycoplasmen durch Fluorochromierung mit DAPI 2.7.2.2  ELISA-Test auf Mycoplasmen 2.7.2.3  Nachweis von Mycoplasmen mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) 2.7.2.4  Mycoplasmennachweis durch spezifische Enzymbestimmung 2.7.3  Elimination von Mycoplasmen Tests nur in antibiotikafreien Kulturen Einbettmittel für Fluoreszenzpräperate DAPI-Test auf Mycoplasmen PCR-Test auf Mycoplasmen Behandlung von Zellkulturen gegen Mycoplasmen 2.8  Kreuzkontaminationen 2.8.1  Methodik des STR-Profiling 2.8.2  Vermeidung von Kreuzkontaminationen Zusammenfassung Weiterführende Literatur 3 Sicherheit in der Zellkultur 3.1  Sicherheitsvorschriften 3.2  Gesetzliche Regelwerke 3.3  Entsorgung Generelle Probleme Weiterführende Literatur II Die Zelle und ihre Umgebung Inhaltsverzeichnis 4 Zellbiologische Grundlagen der Zell- und Gewebekultur Weiterführende Literatur 5 Kulturgefäße und ihre Behandlung 5.1  Züchtung von Zellen auf Glas 5.2  Züchtung von Zellen auf Plastikmaterial 5.3  Züchtung von Zellen auf anderen Materialien 5.4  Spezielle Kulturgefäße 5.4.1  Kulturflaschen 5.4.2  Petrischalen, Vielfachschalen und Mikrotiterplatten 5.4.3  Wannenstapel und andere Kulturgefäße 5.4.4  Deckgläser und Objektträger 5.4.5  Reagenzgläser, Zentrifugengläser und andere Kulturröhrchen 5.5  Reinigung und Vorbehandlung von Glaswaren Reinigung neuer Glaswaren Reinigung gebrauchter Glaswaren Mikrobiologische Dekontamination von Glaswaren Reinigung von Deckgläsern Reinigung von Objektträgern Pipettenreinigung Silikonisieren von Glaswaren Entfernen von Silikon Prüfen des Wascheffektes. 5.6  Vorbehandlung von Kulturgefäßen mit Polylysin oder mit Komponenten der extrazellulären Matrix zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften Beschichten von Oberflächen mit Polylysin Beschichten von Oberflächen mit Kollagen Beschichtung mit Kollegen Typ IV Beschichten von Oberflächen mit Fibronectin Beschichten von Oberflächen mit Laminin Beschichten von Oberflächen mit Vitronectin Beschichten von Oberflächen mit Basement Membrane Matrigel™ Beschichten von Oberflächen mit Gelatine Beschichten von Oberflächen mit fetalem Kälberserum Zusammenfassung Weiterführende Literatur 6 Zellkulturmedien Allgemeine Aspekte der Kulturmedien 6.1  Zusammensetzung der Medien 6.1.1  Grundkomponenten 6.1.2  Zusätze zu Kulturmedien 6.1.2.1  Glucose und andere Kohlenhydrate 6.1.2.2  Aminosäuren 6.1.2.3  Glutamin 6.1.2.4  Pyruvat 6.1.2.5  Vitamine 6.1.2.6  Spurenelemente 6.1.2.7  β-Mercaptoethanol 6.1.2.8  Lipide 6.1.3  Serum 6.1.4  Alternativen zur Verwendung von Serum in der Zellkultur Herstellung proteinarmer Thrombocytenlysate Zusammenfassung wichtiger Grundsätze 6.2  Kurze Beschreibung der gebräuchlichsten Kulturmedien 6.3  Herstellung gebrauchsfertiger Medien Herstellung eines Mediums aus gebrauchsfertigen Teillösungen Herstellung eines Mediums aus dem 10× Konzentrat Herstellung eines Mediums aus einer Pulvermischung Autoklavierbare Medien Zusammenfassung: Allgemeine Grundsätze in der Herstellung und Verwendung von Zellkulturmedien Weiterführende Literatur 7 Serumfreie Zellkultur 7.1  Grundmedien 7.2  Zusätze zu serumfreien Medien 7.3  Modularer Aufbau serumfreier Medien 7.4  Übergang von serumhaltigen zu serumfreien Medien Umstellung auf serumfreies Medium 7.5  Serumfreie und proteinfreie Kulturmedien Weiterführende Literatur 8 Physiologische Zellkulturparameter 8.1  Osmolarität 8.2  Temperatur 8.3  Oxygenierung 8.4  pH-Wert und Pufferung 8.4.1  NaHCO3 8.4.2  HEPES 8.4.3  Phenolrot Weiterführende Literatur 9 Reinstwasser für Zell- und Gewebekulturen 9.1  Verfahren der Aufbereitung, Vorbehandlung 9.2  Reinstwasseraufbereitungssysteme 9.3  Lagerung von Reinstwasser 9.4  Wasser für Reinigungszwecke Weiterführende Literatur III Routinemethoden zur allgemeinen Handhabung kultivierter Zellen Inhaltsverzeichnis 10 Mediumwechsel und Fütterungszyklen 10.1  Mediumwechsel bei Monolayerkulturen Mediumwechsel bei Monolayerkulturen 10.2  Mediumwechsel bei Suspensionskulturen Mediumwechsel bei Suspensionskulturen Weiterführende Literatur 11 Subkultivierung/Passagieren Shake-off-Verfahren Hinweis Passagieren mit Trypsinlösung Passagieren mit Trypsin–EDTA-Lösung Modifikation beim Passagieren serumfreier Zellkulturen mit Trypsin Passagieren serumfreier Zellkulturen mit TrypLE™ Passagieren von Stammzellen mit Accutase™ Passagieren von Monolayerkulturen mit Dispase Passagieren durch Abschaben 11.1  Subkultivierung von Monolayerkulturen 11.1.1  Abklopfen der Zellen (Shake-off-Verfahren) 11.1.2  Passagieren der Zellen mit Trypsin bzw. Trypsin–EDTA 11.1.3  Passagieren von Monolayerkulturen mit anderen proteoloytischen Enzympräparationen 11.1.4  Passagieren von Monolayerkulturen durch Abschaben 11.1.5  Einsäen der Zellen Einsaatdichte (seeding density) und Verdünnungsfaktor (split ratio) 11.2  Subkultivierung von Suspensionskulturen Subkultivierung von Suspensionskulturen Weiterführende Literatur 12 Bestimmung allgemeiner Wachstumsparameter Dokumentation der Kulturen 12.1  Mikroskopische Betrachtung der Kulturen Bestimmung der Zellzahl mittels Zählkammer Bestimmung der Lebendzellzahl durch elektronische Zellzählung am Beispiel des CASY® Cell Counter, Model TT, Roche Diagnostics GmbH) Gerätevoreinstellung für die Zählung von z. B. U937 Zellen (. Abb. ) Allgemeine Vorbereitung Zählung der Probe Pflege des Gerätesystems Zellpopulationsverdopplung 12.2  Bestimmung der Zellzahl (und Zellmasse) 12.2.1  Bestimmung der Zellzahl in Suspensionen 12.2.2  Zellzählung mit elektronischen Zählgeräten 12.2.3  Bestimmung der Zellzahl in Monolayerkulturen 12.2.4  Wachstumskurve und Populationsverdopplungszeit 12.2.5  Zellmasse Bestimmung des Gesamtproteins einer Kultur Hinweis 12.3  Bestimmung allgemeiner Stoffwechselparameter 12.3.1  Nährstoffverbrauch und Stoffwechselraten 12.3.2  Spezifische Zellprodukte Resazurin Assay Trypanblaufärbung MTT-Test auf Lebensfähigkeit WST-8 Test Alternative Assays 12.4  Vitalitätstests 12.4.1  Vitalfärbung zur Testung auf Lebensfähigkeit von Zellen 12.4.2  Tetrazolium-Tests zur Messung von Lebensfähigkeit und Wachstum 12.4.3  Proliferationsassays 12.4.4  Anheftungseffizienz (Plating Efficiency) Plating Efficiency Weiterführende Literatur 13 Einfrieren, Lagerung und Versand von Zellen Einfrieren von Zellen 13.1  Einfrieren von Zellen 13.2  Lagerung der Zellen Auftauen von Zellen Problembehandlung 13.3  Auftauen von Zellen Versand von Zellen Probleme mit Zellen 13.4  Versand von Zellen Weiterführende Literatur 14 Qualitätskontrolle und Cell Banking 14.1  Qualitätskontrolle 14.1.1  Herkunft und Authentizität der Zellen 14.1.2  Identifizierung der Zellen 14.1.3  Kontaminationen mit Mycoplasmen 14.1.4  Kreuzkontamination mit anderen Zellen 14.2  Cell Banking Weiterführende Literatur 15 Standardisierung in der Zellkultur (Good Cell Culture Practice) Weiterführende Literatur IV Spezielle Methoden und Anwendungen Inhaltsverzeichnis 16 Allgemeine Aspekte der Primärkultur 16.1  Anlegen einer Primärkultur Entwicklung einer Zelllinie nach Hayflick und Moorhead (1961) 16.2  Etablierung einer Zelllinie, Zellalterung und Seneszenz 16.3  Apoptose in der Zellkultur 16.3.1  Ablauf und Regulation der Apoptose 16.3.2  Bestimmungsmethoden zur Apoptose in der Zellkultur Probleme mit transformierenden Genen Viruszüchtung Transformation 16.4  Transformation und Immortalisierung 16.4.1  Entwicklung kontinuierlicher Zelllinien 16.4.2  Induzierte Transformation von Zellen 16.4.3  Virusvermehrung und Transformation mit Epstein-Barr-Viren (EBV) 16.4.4  Die Immorto-Maus® Weiterführende Literatur 17 Spezielle Primärkulturen 17.1  Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens 17.2  Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen 17.3  Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs Isolierung von Lymphocyten 17.4  Isolierung von Lymphocyten aus Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation Primärkultur von Granularzellen aus dem Mäusecerebellum 17.5  Primärkulturen aus Mäusecerebellum (Kleinhirn) Primärkultur von Hepatocyten Kultivierung primärer Hepatocyten auf Kollagensandwich Primärkultur von Nichtparenchymzellen (Kupffer-Zellen) 17.6  Primärkulturen von Hepatocyten Gewinnung von Endothelprimärkulturen aus Schlachtmaterial (Lungenarterie vom Kalb) Isolierung von Endothelzellen und glatten Muskelzellen aus Humanarterien Doppelfärbung zur Charakterisierung von Endothelzellen (EC) oder glatten Muskelzellen (SMC) kombiniert mit DNA-Färbung 17.7  Isolierung und Primärkultur von Endothelzellen Primärkultur aus solidem Humantumor 17.8  Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren Primärkultur aus Spalthaut Primärkultur aus Mäusehaut Zusammenfassung 17.9  Gewinnung von Keratinocyten 17.9.1  Gewinnung von humanen Keratinocyten 17.9.2  Gewinnung einer Keratinocyten-Primärkultur aus Mäusehaut Weiterführende Literatur 18 Kultivierung spezieller Zelllinien 18.1  Mammaliazelllinien 18.1.1  Mausfibroblasten (3T3-Zellen) 18.1.2  Nierenepithelzelllinien 18.1.2.1  Die Madin-Darby-Canine-Kidney (MDCK) Linie 18.1.2.2  Die LLC-PK1 Schweinenieren-Epithelzelllinie 18.1.3  Kultivierung von Epithelzellen auf mikroporösen Unterlagen (Filtereinsätzen) 18.1.4  Nierenzelllinien aus der normalen Ratte 18.1.5  Intestinale Epithelzelllinien 18.1.6  Phäochromocytomzellen PC-12 Kultivieren und Passagieren von NIH/3T3-Fibroblasten Kultivierung von MDCK-Zellen Kultivierung von LLC-PK1-Zellen Kultivierung transportierender Epithelzelllinien auf Filtereinsätzen Kultur von Phäochromocytomzellen PC-12 18.2  Kaltblütige Vertebraten 18.2.1  Fischzellkulturen Subkultivierung von Fischzellen 18.3  Invertebraten Subkultur von adhärenten Invertebratenzellen 18.4  Insektenzellen für die biotechnologische Produktion rekombinanter Proteine (Sf9-Zellen aus Spodoptera frugiperda) 18.4.1  Das Baculovirus-Expressionssystem 18.4.2  Insektenzelllinien 18.4.3  Aufbewahrung und Lagerung Kultur von Sf9-Zellen und Virusinfektion Aufbewahrung von Insektenzelllinien Tiefgefrierkonservierung von Insektenzellen Weiterführende Literatur 19 Spezielle zellbiologische Methoden in der Zellkultur 19.1  Transfektion 19.1.1  Transfektion nach der Calciumphosphatmethode 19.1.2  Lipofektion 19.1.3  Transfektion mittels Elektroporation 19.1.4  Gene Editing kultivierter Zellen mittels CRISPR/Cas9 Bestimmung der cytotoxischen Geneticinkonzentration Transfektion Lipofektion in nicht adhärenten Zellen Elektroporation 19.2  Klonieren 19.2.1  Limited-Dilution-Klonierung 19.2.2  Klonierung in Weichagar 19.2.3  Isolierung von adhärenten Zellklonen Limited-Dilution-Klonierung von Hybridomzellen Klonierung in Weichagar Isolierung von adhärenten Zellklonen 19.3  Zellfusion, Hybridomatechnik 19.3.1  Prinzipieller Verfahrensablauf 19.3.2  Antigene und Adjuvantien 19.3.3  Tierwahl für die Immunisierung 19.3.4  Immunisierung 19.3.5  Kultur der Myelomzellen 19.3.6  Konditionierte Medien und „Feeder“-Zellen 19.3.7  Elektrofusion von Zellen 19.3.8  Screening tierischer Hybride Fusion von Mäusezellen mit Polyethylenglykol (PEG) Elektrofusion von Zellen Screening auf das Vorhandensein von Antikörpern 19.4  Zellsynchronisation 19.4.1  Zellsynchronisation durch Abkühlen 19.4.2  Zellsynchronisation durch Abschütteln mitotischer Zellen 19.4.3  Zellsynchronisation durch Colcemid-Block 19.4.4  Zellsynchronisation durch Serumentzug 19.4.5  Synchronisation durch Doppelthymidinblock 19.4.6  Zellsynchronisation durch Isoleucinmangel 19.4.7  3H-Thymidineinbau als Proliferationskontrolle Zellsynchronisation durch Schütteln und Abkühlen Zellsynchronisation durch Colcemid-Block Zellsynchronisation durch Serumentzug Synchronisation durch Doppelthymidinblock Zellsynchronisation durch Isoleucinmangel 3H-Thymidineinbau 19.5  Cytometrie/Cell Sorting 19.5.1  Klonierung von Zellen mittels eines FACS 19.5.2  Bestimmung der Zellzykluszeit einer proliferierenden Population mittels Bromdesoxyuridineinbaus 19.5.3  Bestimmung von verschiedenen Subpopulationen aus peripheren Humanleukocyten Bestimmung des DNA-Gehalts von proliferierenden Zellen DNA-Syntheserate mit dem BrdU-Antikörper Bestimmung von Leukocyten-Subpopulationen 19.6  Versuche zur In-vitro-Toxizität 19.6.1  Cytotoxizitätsprüfung 19.6.1.1  Zellkulturmethoden 19.6.1.2  Konzentration der applizierten Substanz in vitro und zeitlicher Verlauf der Applikation 19.6.1.3  Erholungsperiode 19.6.1.4  Endpunkte 19.6.2  Methoden zur In-vitro-Toxizitätsprüfung 19.6.2.1  Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften einer Substanz 19.6.2.2  Prüfung auf akute Zelltoxizität 19.6.2.3  Nachweis mutagener Substanzen 19.6.2.4  Inhibition des Zellwachstums (quantitative Neutralrotmethode) Prüfung auf wachstumshemmende Eigenschaften einer Substanz mithilfe von Mausfibroblasten (L929) bzw. Humanfibroblasten (MRC 5) Prüfung auf akute Zelltoxizität (Agardiffusionstest) Nachweis mutagener Substanzen Inhibition des Zellwachstums 19.7  Migrationsassays 19.7.1  Transendotheliale/transepitheliale Migration 19.7.1.1  Mechanismen der transendothelialen/transepithelialen Migration von Leukocyten 19.7.1.2  Präparation neutrophiler Granulocyten 19.7.1.3  Kultivierung der Zellen auf Filtermembranen 19.7.1.4  Transmigrationsversuche Präparation neutrophiler Granulocyten A. Kultivierung der Zellen auf der Filteroberseite Ablauf der Transmigration 19.8  Chromosomenpräparation Chromosomenpräparation Weiterführende Literatur 20 Organkulturen, 3D-Kulturen, Organoide und mikrophysiologische Systeme (Organ-on-Chips) 20.1  Organkulturen 20.1.1  Präparation eines Säugerdünndarms als Beispiel für eine Organpräparation in der Pharmakologie 20.1.2  Präparation eines peripheren Nerven (oberes Halsganglion) zur Messung der neuronalen Übertragung (Neurotransmission) 20.1.3  Leberschnitte in vitro 20.1.3.1  Testung der Leberschnitte auf Fibrinogen Präparation eines Meerschweinchenileum Präparation eines peripheren Nerven (oberes Halsganglion) zur Messung der neuronalen Übertragung (Neurotransmission) Herstellung der Leberschnitte ELISA-Test auf Fibrinogenproduktion 20.2  Dreidimensionale (3D-)Kulturen, Organoide und 3D-Biodruck Kultur von Sphäroiden Modellierung von Wirt-Krankheitserreger-Wechselwirkungen in einem respiratorischen, humanen 3D-Barriere-/Immunmodell 20.3  Mikrophysiologische Systeme (Organ-on-Chips) Vergleich von Zellkulturmedien Weiterführende Literatur 21 Stammzellen 21.1  Embryonale Stammzellen 21.2  Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Kultivierung von humanen induziert pluripotenten Stammzellen (hiPSC) 21.3  Adulte Stammzellen 21.3.1  Gewinnung und Kultur hämatopoetischer Stammzellen Protokoll zur Kultivierung mesenchymaler Stammzellen aus abgesaugtem Fettgewebe (adipose-derived stem cells, ADSC) Anreicherung von hämatopoetischen Stammzellen aus Vollblut und aus der Nabelschnur von Neugeborenen Depletion cytotoxischer und adhärenter Zellen mittels Leu-Leu-O-Meth-Behandlung Einsatz von ECM-Gel zum Entfernen von adhärenten Zellen 21.4  Embryonaler-Stammzell-Test (EST) (Spezies: Maus) 21.4.1  Grundlegende Verfahren 21.4.1.1  Differenzierung der embryonalen Stammzellen 21.4.1.2  Messung der Cytotoxizität mittels ES-Zellen und 3T3-Zellen mit dem MTT-Test 21.4.1.3  Untersuchung der Differenzierung der ES-Zellen 21.4.1.4  Cytotoxizitätstest mit ES-Zellen und 3T3-Zellen 21.4.1.5  Voraussage des embryotoxischen Potenzials 21.4.2  Dezimale geometrische Konzentrationsreihen 21.4.3  Löslichkeit der Testchemikalien Messung der Cytotoxizität mittels ES-Zellen und 3T3-Zellen mit dem MTT-Test Konzentration der Testchemikalien Verfahrensweise bei der Untersuchung Konzentration der Test-Chemikalien Einsaat der Monolayer und Test-Verfahren A) Allgemeine Bemerkungen Weiterführende Literatur 22 Zellkultur im großen Maßstab, Automatisierung 22.1  Monolayerkulturen für große Zellmengen 22.1.1  Rollerkultur 22.1.2  Wannenstapel (multi-tray, cell factory) 22.1.3  Kapillar-Perfusion (Kapillarreaktor, Dialysator) 22.1.4  Microcarrier-Kultur (Mikroträger) Rollerkultur 22.2  Suspensionskultur für große Zellmengen Anlegen einer Suspensionsmassenkultur 22.3  Automatisierung in der Zellkultur Weiterführende Literatur V Pflanzenzellkultur Inhaltsverzeichnis 23 Pflanzenzell- und Gewebekultur 23.1  Herstellung von Kulturmedien Herstellung von Pflanzenkulturmedien aus käuflichem, vorgemischten Pulvermedium 23.2  Kalluskulturen Kalluskultur (Karottenwurzeln) Subkultivierung von Kalli 23.3  Suspensionskulturen Anlegen von Suspensionskulturen aus Kalluskulturen Subkultivierung von Kallussuspensionskulturen 23.4  Isolierung von Protoplasten aus Pflanzenzellkulturen 23.4.1  Elektrofusion von Pflanzenprotoplasten 23.4.2  Fusion von Protoplasten mittels Polyethylenglykol Isolierung einzelner Pflanzenzellen und Beobachtung des Wachstums während der Kultivierung Fusion von Protoplasten mittels Polyethylenglykol Isolierung und Kultivierung von Protoplasten höherer Pflanzen 23.5  Antherenkultur Antherenkultur bei der Gerste 23.6  Embryonenkultur Embryonenkultur der Gerste 23.7  Einfrieren und Lagerung von Pflanzenzellkulturen Kryokonservierung von Pflanzenzellsuspensionen Weiterführende Literatur A Glossar (Kleines Zell- und Gewebekulturlexikon) B Anhang C Lieferfirmen und Hersteller Stichwortverzeichnis